Hochauflösende Fluoreszenzmikroskopie 17.10.2014

Um die Zelle und ihren Inhalt zu sehen, müssen wir ein Mikroskop nehmen. Das Funktionsprinzip ist relativ einfach: Lichtstrahlen passieren ein Objekt und treten dann in Lupen ein, sodass wir sowohl die Zelle als auch einige der darin enthaltenen Organellen wie den Zellkern oder die Mitochondrien sehen können.

Aber wenn wir ein Protein oder DNA-Molekül oder einen großen supramolekularen Komplex wie ein Ribosom oder ein Viruspartikel sehen wollen, dann ist ein gewöhnliches Lichtmikroskop nutzlos. Bereits 1873 leitete der deutsche Physiker Ernst Abbe eine Formel ab, die den Möglichkeiten jedes Lichtmikroskops Grenzen setzt: Es stellt sich heraus, dass es unmöglich ist, ein Objekt zu sehen, das kleiner als die Hälfte der Wellenlänge des sichtbaren Lichts ist – also kleiner als 0,2 Mikrometer.

Die Lösung besteht offensichtlich darin, etwas zu wählen, das sichtbares Licht ersetzen kann. Sie können einen Elektronenstrahl verwenden, und dann bekommen wir ein Elektronenmikroskop - Sie können Viren und Proteinmoleküle darin beobachten, aber die beobachteten Objekte während der Elektronenmikroskopie geraten in völlig unnatürliche Bedingungen. Daher erwies sich die Idee von Stefan W. Hell vom Institut für Biophysikalische Chemie der Max-Planck-Gesellschaft (Deutschland) als äußerst erfolgreich.

Der Kern der Idee war, dass ein Objekt mit einem Laserstrahl bestrahlt werden könnte, der biologische Moleküle in einen angeregten Zustand versetzt. Aus diesem Zustand beginnen sie, sich in den Normalzustand zu bewegen und sich von überschüssiger Energie in Form von Lichtstrahlung zu befreien - das heißt, die Fluoreszenz beginnt und die Moleküle werden sichtbar. Aber die ausgesandten Wellen werden sehr unterschiedlich lang sein, und wir werden einen unbestimmten Fleck vor unseren Augen haben. Um dies zu verhindern, wird das Objekt zusammen mit dem Anregungslaser mit einem Löschstrahl behandelt, der alle Wellen außer denen mit Nanometerlänge unterdrückt. Strahlung mit einer Wellenlänge in der Größenordnung von Nanometern macht es gerade noch möglich, ein Molekül von einem anderen zu unterscheiden.

Die Methode hieß STED (Stimulated Emission Depletion), und dafür erhielt Stefan Hell seinen Teil des Nobelpreises. Bei der STED-Mikroskopie wird das Objekt nicht auf einmal komplett von der Laseranregung erfasst, sondern gleichsam von zwei dünnen Strahlenbündeln (Exciter und Quencher) angezogen, denn je kleiner die Fläche ist, die gerade fluoresziert, desto höher die Bildauflösung.

Die STED-Methode wurde später durch die sogenannte Einzelmolekülmikroskopie ergänzt, die Ende des XNUMX. Jahrhunderts unabhängig voneinander von zwei anderen aktuellen Preisträgern, Eric Betzig vom Howard Hughes Institute und William E. Moerner von Stanford, entwickelt wurde. Bei den meisten physikalisch-chemischen Methoden, die auf Fluoreszenz beruhen, beobachten wir die Gesamtstrahlung vieler Moleküle gleichzeitig. William Merner hat gerade eine Methode vorgeschlagen, mit der man die Strahlung eines einzelnen Moleküls beobachten kann. Beim Experimentieren mit grün fluoreszierendem Protein (GFP) bemerkte er, dass das Leuchten seiner Moleküle durch Manipulation der Anregungswellenlänge willkürlich ein- und ausgeschaltet werden kann. Durch Ein- und Ausschalten der Fluoreszenz verschiedener GFP-Moleküle konnten sie in einem Lichtmikroskop beobachtet werden, wobei die Abbe-Nanometer-Beschränkung ignoriert wurde. Das gesamte Bild konnte durch einfaches Kombinieren mehrerer Bilder mit unterschiedlichen leuchtenden Molekülen im Sichtfeld erhalten werden. Ergänzt wurden diese Daten durch die Ideen von Eric Betzig, der vorschlug, die Auflösung der Fluoreszenzmikroskopie durch die Verwendung von Proteinen mit unterschiedlichen optischen Eigenschaften (also grob gesagt mehrfarbig) zu erhöhen.

Die Kombination von Hells Excitation-Quenching-Methode mit der Betzig-Merner-Summenimpositionsmethode hat es ermöglicht, Mikroskope mit Nanometerauflösung zu entwickeln. Mit seiner Hilfe können wir nicht nur Organellen und deren Fragmente beobachten, sondern auch die Wechselwirkungen von Molekülen untereinander (wenn die Moleküle mit fluoreszierenden Proteinen markiert sind), was, wie gesagt, mit elektronenmikroskopischen Methoden bei weitem nicht immer möglich ist. Der Wert der Methode ist kaum zu überschätzen, denn intermolekulare Kontakte sind das, worauf die Molekularbiologie steht und ohne die beispielsweise weder die Entwicklung neuer Medikamente, noch die Entschlüsselung genetischer Mechanismen oder vieles andere, was dahinter steckt, unmöglich ist Bereich der modernen Wissenschaft und Technik.